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IEEE-NANO 2019收錄東納生物快速熒光定量平臺 檢測沙門氏菌新成果

日期: 2019-08-12
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沙門氏菌是一種革蘭氏陰性菌,其包含超過2,600種能夠在多種宿主中引起感染的血清型。該菌是胃腸道感染的最常見原因之一,沙門氏菌的感染源主要包括牛奶,雞蛋,肉類(家禽,牛肉),蔬菜和新鮮水果。每年導致全球數以千萬計的感染病例。在加拿大,沙門氏菌是最常見的食源性疾病的病原菌。在每年發生的400萬例食源性疾病中,非傷寒沙門氏菌占加拿大報告感染的約41%。歐盟每年報告超過100,000例沙門氏菌病,其中人類沙門氏菌病的費用每年估計高達30億歐元。在美國,由于受沙門氏菌污染的食物來源的影響,社會工作效率降低、醫療保健成本增加,估計每年造成33億美元的損失。在許多低收入和中等收入國家,沙門氏菌所造成的經濟和社會損失更是難以測算。此外,沙門氏菌也是動物飼料和寵物食品中的主要致病性微生物。這些飼料的安全性不僅關乎動物健康,還關乎動物源食品或處理寵物食品的人員健康。

為了減少與食品和飼料產品相關的沙門氏菌爆發和疾病,需要從農場到餐桌進行多環節的檢測和控制。目前,沙門氏菌檢測和鑒定的標準方法主要包括細菌分離和生化鑒定。 基于培養法的細菌分離雖然結果可信度高,但耗時費力(通常需要5-7天)且在腸桿菌科下不同物種之間可發生交叉生化反應。以聚合酶鏈反應(PCR)為代表的高靈敏度和特異性的核酸擴增方法已廣泛應用于沙門氏菌等病原微生物的檢測。然而,檢測結果的判斷主要依賴于傳統的瓊脂糖凝膠電泳檢測,由于需使用含有毒性的核酸染料等試劑,實驗安全性有待提高。實時熒光定量PCR技術等能夠在不使用有毒試劑的情況下對靶標進行定量檢測,但由于儀器和試劑成本較高而未能在基層和實際檢驗工作中廣泛使用。因此,亟需開發一種能夠提高沙門氏菌檢出率,縮短檢測時間,不需要昂貴的設備和試劑的分子檢測方法以有效防控沙門氏菌的傳播。


隨著納米材料與技術的發展,磁性微球(磁珠)成為分子細胞生物學研究、分子診斷、免疫診斷及細胞分選中極為重要的工具和核心原材料。MagBeadsTM磁性微球系列是東納生物的明星產品,其采用經典的核殼結構設計制造,內核為聚合物微球,外層為磁性物質,最外層采用特殊聚合物修飾,具有尺寸分布均一、表面負載量高、極短的磁響應時間、高的分散穩定性等特點,可以快速、高效地從樣本中分離出待測物,極大地提高檢測效率。目前MagBeadsTM系列磁性微球已廣泛應用于核酸提取、DNA捕獲與傳感技術、PCR產物純化、測序產物純化、核酸轉染、抗體純化、細胞分選、特定蛋白分離、化學發光檢測、模擬酶等諸多領域,獲得眾多知名的大學、研究機構與臨床診斷實驗室研究人員的廣泛好評。

IEEE-NANO 2019收錄東納生物快速熒光定量平臺  檢測沙門氏菌新成果

1MagBeadsTM系列磁性微球

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基于東納生物研發團隊在MagBeadsTM系列磁性微球的研究基礎,東南大學生物醫學工程學院研究人員與東納生物合作開發出一種PCR產物磁珠法純化聯合快速熒光定量檢測試劑盒PCR-LFIA),使用磁珠去除PCR產物中的引物二聚體,使用熒光微球作為熒光信號放大器,確保檢測的靈敏度和準確度。使用配套檢測平臺Nanoeasy 1700,可快速實現檢測結果數字化定量。該試劑盒在保持PCR特異性的基礎上,靈敏度可比普通PCR2~3個數量級,與熒光定量PCR相當,且不涉及有毒試劑。儀器簡便、易于攜帶,通過互聯網可實時共享測試結果。PCR-LFIA檢測法快速,靈敏,特異且安全,在疾病診斷、食品檢驗和環境微生物監測方面具有廣泛的應用潛力,尤其適合即時診斷(POCT)應用。


IEEE-NANO 2019收錄東納生物快速熒光定量平臺  檢測沙門氏菌新成果

2:快速熒光定量檢測平臺Nanoeasy 1700和系列試劑盒

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在寵物病原微生物檢測研究的基礎上,項目組研究人員以沙門氏菌(Salmonella spp.)為檢測對象,基于沙門氏菌特異性保守基因bcf設計擴增引物,優化出LFIA的最佳工作反應體系(100 μL)和反應時間(2 min)。經18株細菌標準株驗證,PCR-LFIA法能特異性地檢測出沙門氏菌。檢測靈敏度為6×100 CFU/mL(純培養物)或6×102 CFU/mL(人工糞便感染物),且與常規培養法在分離樣品中的檢測結果一致(7.1%陽性,6/85),Cut-off值為175。檢測結果通過Sanger測序和BLAST進一步驗證。從PCR步驟開始整個過程僅需約80分鐘。

研究成果已被2019 IEEE 19th International Conference on NanotechnologyIEEE-NANO)收錄,相關成果已經申請國家發明專利。

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IEEE-NANO 2019收錄東納生物快速熒光定量平臺  檢測沙門氏菌新成果

3PCR-LFIA法檢測沙門氏菌示意圖

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4PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的建立. APCR產物純化試劑盒在沙門氏菌擴增產物上的應用結果;B,通過暗場成像觀察PCR產物純化試劑盒的純化效果;C,快速熒光定量檢測平臺測試PCR產物純化結果

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IEEE-NANO 2019收錄東納生物快速熒光定量平臺  檢測沙門氏菌新成果

5PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的靈敏度測試. APCR結果使用瓊脂糖凝膠電泳驗證;B,快速熒光定量檢測平臺讀取PCR結果;C,梯度稀釋的樣品對應的熒光值標準曲線


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6PCR-LFIA法檢測沙門氏菌方法的特異性測試.


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7PCR-LFIA法檢測沙門氏菌人工糞便感染物靈敏度測試.

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8PCR-LFIA法檢測分離樣品中沙門氏菌的結果

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參考文獻

1. Yoshida C, Gurnik S, Ahmad A, Blimkie T, Murphy SA, Kropinski AM, Nash JH. Evaluation of molecular methods for identification of Salmonella serovars. J Clin Microbiol. 2016, 54(8): 1992-8.

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3. Zhuang L, Ji Y, Tian P, Wang K, Kou C, Gu N, Zhang Y. Polymerase chain reaction combined with fluorescent lateral flow immunoassay based on magnetic purification for rapid detection of canine parvovirus 2. BMC Vet Res. 2019, 15(1): 30.

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